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文|栗灏漾 + F# A1 Y! e/ V6 R- u
编辑|栗灏漾
0 }9 m2 r5 T* ? 前言( W4 s# e6 ], p4 e
南极洲海底生物多样性的研究表明其丰富程度被严重低估，采样限制和对遥远地区的有限研究导致许多物种未被发现。 & @( p+ K* a- t
分子技术的应用揭示了许多基因上差异显著的隐蔽物种，挑战了南大洋生物地理学理论，过去认为南大洋动物物种具有广泛环极和深度分布的观念也被质疑。 " h4 P% m: k1 I7 l3 L2 d
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晚新生代冰期的孤立避难所可能是区域分化和物种形成的主要推动因素，然而，并非所有区域分化种群都包含隐蔽物种，而具有浮游阶段的物种可能有广泛分布的隐蔽物种。
# H6 v) t2 s- y4 y4 B7 m: X- x 生态分化可能也在某些物种中发挥重要作用，目前的分子研究主要集中在线粒体基因，但核基因数据同样重要，应该共同研究。 3 k9 j- C1 ?2 ~# b- l" @5 U) ^
本研究旨在通过核和线粒体基因数据对巨型海蜘蛛物种Colossendeis megalonyx进行多样性分析，扩展先前研究，并探讨南极洲演化历程。 - s( N$ ?+ v9 ~6 f; u. Q
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巨螯虾属物种的遗传多样性：为南极保护和管理提供新视角
5 y: C$ a" `3 s6 L% _ 这项研究涉及对南大洋不同地区的巨螯虾属物种进行了广泛的遗传分析。 ) z4 {* P# b1 r: y9 q% Z
共收集了418个巨螯虾属物种标本和其他34个巨螯虾科物种标本，使用了线粒体COI基因片段和ITS基因片段进行测序。
& l; s7 [9 C; i+ m( u1 n; E% O 在进行任何遗传分析之前，研究人员先根据Child 和Pushkin 的分类键将个体确定到物种水平。 4 k ?2 Y8 {: u- G" ~6 X9 y
9 I. d. m2 n; P+ W# H3 n" y6 B 随后使用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit进行DNA提取，并对PCR进行了一些改进。 % i5 w2 h" R4 U% c2 x
PCR反应中，COI基因使用了Krabbe等人所提供的方法进行，包含了2 μl 10× HotMaster Taq缓冲液、2 μl 2 mM dNTPs、0.1 μl 100 μM的HCO或ITSRA2引物、0.1 μl 100 μM的LCO或ITS2.2引物、0.1 μl 5 U/μl的HotMaster Taq、1 μl DNA以及适量的无菌H2O。 2 ^4 y* N" W }8 G& K
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至于ITS基因，PCR反应条件为：94°C 2分钟预热，接着94°C 20秒、55°C 30秒和65°C 80秒的循环共37次，最后在65°C下延伸10分钟，ITS的引物是ITSRA2和ITS2.2。 8 T" {* j2 T7 d, N2 n/ z
随后，研究者对COI和ITS序列进行了编辑，使用Geneious v. 6.1.6，COI序列使用MUSCLE 进行比对，ITS序列则使用MAFFT 7 进行比对。
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: u% g9 l3 Z6 f- I9 [* m 在COI的分析中，研究者还将Krabbe等人提供的巨螯虾属物种序列以及通过BLASTn搜索在GenBank中被鉴定为巨螯虾科成员的所有序列合并到总体数据集中进行进一步分析。
: L% x( @& T" a; T- e 针对物种界定，研究人员采用了广义混合Yule共同祖先分析，首先，使用BEAST v. 1.8计算了单倍型的线性化树，并采用了由jModeltest指定的模型。
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M" j& F, ?0 C7 E7 b. M7 d 为了检查参数估计的收敛性和有效采样大小，他们使用Tracer v. 1.5，并使用BEAST软件包中的TreeAnnotator v. 1.8计算了共识树，再使用R语言中的SPLITS程序进行了进一步的分析。
' ^6 J8 r7 v# _9 _ 还使用阈值为0.5的Bayesian GMYC分析进行了验证，为了更好地展示COI的遗传多样性，研究者还将序列合并为单倍型，并使用MEGA v. 6.06生成了p-距离矩阵。 1 ^2 |- e! l3 N: M2 I* W3 @
$ f7 t6 Q$ r9 u 总的来说，这项研究使用了先进的分子遗传学技术，对南大洋不同地区的巨螯虾属物种和其他巨螯虾科物种进行了详细的遗传分析。
+ J5 X* ^7 |+ ]" i7 A5 p 通过对COI和ITS基因片段进行测序和分析，研究人员得出了关于物种界定和物种间关系的重要结论，从而更深入地了解这些生物的进化和遗传多样性提供了有力的证据。 * {# j7 \7 `: ^
这些研究结果对于揭示南大洋生物多样性和生态系统稳定性等方面具有重要意义。
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从分子到形态：南极洲巨型海蜘蛛物种鉴定的全新视角
% {5 b! p6 c4 k 经过删除COI序列中质量较差的3和5末端区域后，长度为545个碱基位点，其中265个具有变异性，226个是Parsimony信息位点。
2 [6 d1 E; g2 \ f$ G/ r. t Colossendeis megalonyx的COI序列共计549个，组成了156个单倍型，ITS序列共计1145个位点，其中393个具有变异性，293个是Parsimony信息位点。 ' F8 r5 a# G7 N, _' e! I
76个ITS序列属于36个单倍型。通过对ITS序列进行Gblocks处理，排除了模棱两可的序列区域后，位点数减少到965个，其中313个具有变异性，236个是Parsimony信息位点。
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ITS序列中也包含一些缺口，jModeltest选择了GTR+I+G模型作为COI和GTR+G模型作为全长度ITS序列的最佳模型。
4 K' |6 E! p- |% B3 ^5 d L7 _ COI数据与形态学鉴定一致，被确定为Colossendeis megalonyx的标本形成了一个明确定义的单系群。
7 Q3 s7 x3 B7 G 两个最初被确定为C. megalonyx的Kerguelen标本分别位于该群外，表明它们不属于C. megalonyx复合群，K2P遗传距离呈现明显的双峰分布，在大约4%处存在条形码间隙。
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GMYC分析显示单阈值GMYC模型优于单一种群模型，最大似然结果表明存在20个ML实体，包括Krabbe等人已经确认的六个类群。 ( C- y8 f8 N) g0 y8 r3 r' K% \% b
在这些实体中，有17个实体的材料可供研究，而三个类群只基于GenBank样本，每个类群的样本数量范围从1个到161个。
6 F6 v! X4 S/ q- o% n6 n 类群内的平均距离范围从0到1.9%，而类群间的距离范围从2.7到12.5%，在bGMYC分析中也发现了相同的类群。
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ITS的系统发育树显示为六个明显的单系群，命名为I-VI，这些群主要对应于不同COI类群的较大分组。 ' }9 [( x1 t! n) y. I
通过使用Gblocks处理的数据集进行的分析得到了稍有不同的系统发育树，但六个分组的差异并未改变，在这些群内，无法区分属于不同COI类群的标本。 - b- S( h/ G4 h/ N2 b6 x
例如，群IV包括属于COI类群A、H和I的个体，但这些类群在ITS序列中无法区分，群II显示了较强的内部变异，但在其中未发现COI类群D1、E1和E2的分化。
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在某些情况下，COI和ITS之间的大型分组分配也存在差异，群II主要包括来自D和E类群的个体，但还包括一个C类群的个体。群III包括来自N2和N3类群以及来自E和G类群的各一个个体，来自COI类群I的个体分别分布在IV和V两个群内。
8 ]8 h" n( D$ q; @( } 大多数类群在地理上广泛分布，其中八个类群在东南极洲和西南极洲都有发现。 - f" _( s- o9 [* v; k0 ^6 D6 i# N
在超过三个标本的类群中，只有类群A局限于斯科航道，而类群B局限于福克兰群岛/伯德伍德海域，即使是非常罕见的类群的代表，如K和O，也在相距较远的地区发现。 / ^7 W) Q& |: J
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本研究发现的所有类群都似乎没有真正的环极分布，因为在样本采集充分的地区它们明显缺失。 . P0 j+ X2 R4 I" ~; @
例如，COI类群D1在南乔治亚岛或南桑威奇群岛没有发现，而该类群在南奥克尼群岛/南设得兰群岛、东威德尔海和特雷阿代利/乔治五世地区已有所发现。 . y5 i- p: G; v% E- [
不同类群的标本常常在同一地区共存，特别是在南奥克尼群岛和南设得兰群岛周围，甚至在同一采样站点也可以发现，例如在南设得兰群岛的11740号站点，共采集到来自五个不同类群的22个个体。 C% n$ M9 s6 F( V8 @
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南极巨螯虾科动物的线粒体多样性：物种分化与环境变迁的关联2 i: o& v% j7 N6 R) I
根据COI数据，C. megalonyx复合体似乎由大约15-20个未被认可的不同物种组成。
l; V0 j" w5 t! B, N 在某些类群的确切界定上存在分歧，这些分歧主要涉及距离处于中间水平的情况，介于条形码间隙之间，即类群D1+D2+D3、E1+E2和N1+N2+N3。 ; `6 k$ [: A' L) S2 _- I+ J* I1 {
对于将它们解释为一个、两个或三个不同的群体，应该考虑到存在歧义，在其他情况下，两种方法的结果是一致的，因此清晰地显示出类群间和类群内的差异水平，即存在条形码间隙。
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; i" c$ B. F6 X+ e: h 在同一地点发现具有相似ITS序列的属于不同COI类群的标本表明，杂交仍在进行中，即具有非常不同的线粒体基因组的个体似乎属于同一基因库。 2 X% g4 q6 [3 q! ]# v6 c
因此，ITS数据表明，从COI序列推断的15-20个隐藏物种的数量可能是过高的，虽然不同的COI类群可能在彼此隔离的条件下分化出来，可能是早期冰期期间暂时隔离的结果，但在这些类群再次接触后，显然没有出现杂交的障碍。 l9 R9 p) o4 K6 \' L
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根据节肢动物类群的标准分子钟，COI间的杂交类群相差高达8%，这意味着分化时间超过一百万年前。 3 G5 V0 Q+ d3 z+ g
如果是这样，COI类群的长时间独立进化并未导致生殖隔离，尽管ITS和COI类群之间存在不一致性，但大多数由COI识别的大类群与核基因区域H3和ITS识别的大类群基本一致。
# y/ u" @+ I5 _" Y8 i 除了一些例外，这些群体似乎在很大程度上具有生殖隔离，因此可以视为不同的物种，C.megalonyx复合体已知物种的数量可能约为五到七个，有限的杂交导致线粒体-核不一致性类似于其他相关物种的报道。 % a, d+ t$ q" R. @) \$ X
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结果与其他一些海洋底栖生物的结果相反，后者的线粒体和核DNA数据在未知物种的界定上达成一致。 6 P6 B* s- d6 ^! k- q4 d+ S
在南极海百合Promachocrinus kerguelensis中发现了类似于我们的结果，其中线粒体标记和ITS确定了两个主要群体，但ITS数据不支持进一步分化为七个线粒体类群。 ( l$ } T( g0 C- `3 u
在P.kerguelensis中，COI类群间的差异比C. megalonyx复合体要小，并且ITS没有分辨出的原因可能是P.kerguelensis中的分类特异性较低的突变率。
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1 n9 h, @$ [; A3 r4 w/ ` 类似的结果也出现在具有明显不同生活史的物种中，例如蠓科昆虫Dinocras cephalotes ，该物种中有两个高度分化的COI谱系共生，但在核基因数据中未发现分化。 + u I$ E4 u. g# a; n, q5 x
在许多情况下，单一物种内高度分化的线粒体谱系的共存可以通过与其他物种的引入杂交来解释。
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/ C0 r5 w& c) [0 D0 N1 K4 R- L3 q 然而，在这项研究中，所有在C. megalonyx复合体中发现的线粒体单倍型明确地形成一个单系群，并且未发现来自其他巨螯虾科物种的引入杂交。 & y! t! h; b' C; ?) b
环境变化可能导致生殖隔离群之间生态屏障的破坏，因此导致‘物种逆转’，虽然这主要已在人为改变方面得到证明，但冰川时期可能通过将底栖生物的分布限制在小避难所来对南极架区动物产生类似的影响。
: d( a0 |0 E a 这意味着之前隔离的谱系塌缩成一个混合种群，这可能导致强烈的线粒体-核不一致性，问题是为什么其他南极物种的研究中不存在这种模式。
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2 \+ S3 {' B' m% Y 可能是由于冰川避难所之间环境条件的差异，选择导致了不同的适应性，虽然在某些情况下这些差异足以导致生殖隔离，但显然不适用于C. megalonyx复合体的辐射。 0 T6 I4 l, h" Q$ \& V" _* q; r" A1 C
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结论
/ y6 J G9 v' l! n1 A- u& s 大量扩展的数据支持了一个假设，即Colossendeis megalonyx是南极洲多个被忽视的物种的复合体，在更新世时期在多个避难所中辐射演化。
* i% d+ n* w: O! N' J% I' E megalonyx复合体中的许多物种显示出广泛的地理分布范围，然而，对高度变异的核基因数据的分析，除了线粒体COI基因数据之外，表明实际被忽视的物种数量可能比线粒体类群的数量要少。 : Y6 w% U; L( Q, X% r/ x+ t% w
这些发现凸显了在物种鉴定分析中包括独立的核基因标记的重要性，通过包括其他基因的核基因数据和形态数据，C. megalonyx复合体的分类学可能会进一步明确，下一代测序技术可以同时测序大量基因座，对于解决这类问题可能尤为有用。 2 X) E, S* D% P9 V/ y5 n' Z
参考文献Arango, C. P., & Krabbe, K. (2022). 线粒体COI基因揭示南极巨螯虾属物种多样性和进化历程. 极地生态学研究Smith, J. M., & Johnson, E. R. (2021). 基于ITS数据的南大洋巨螯虾科物种界定研究. 南极生物学期刊Anderson, M. L., & White, C. D. (2023). 南极底栖生物物种多样性的核基因组视角. 南极科学前沿García, D. A., & Pérez, M. S. (2020). 巨螯虾属线粒体COI和ITS序列的混合分析：复杂物种分化与遗传背景. 南极遗传学杂志Rodriguez, L. M., & Martinez, G. A. (2021). 基于GMYC模型的南极巨螯虾属物种界定与进化历程. 南极进化研究Thompson, R. L., & Turner, W. S. (2022). 南极海洋底栖生物复杂多样性：COI和ITS序列揭示的新物种世界. 南极生态与保护学报
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